摘要：
在做生信分析时，我们经常会用到adjusted p-value，而不是直接使用p-value，为什么呢？
1. 假设检验的基础：Type I 错误
在统计学中，假设检验的核心是对一个原假设（\(H_0\)）进行验证。假设检验中可能出现以下两种错误：
Type I 错误（假阳性）： 原假设 \(H_0\) 为真，但我们错误地拒绝它。
假阳性率通常用显著性水平\(α\)表示（比如 0.05）。
Type II 错误（假阴性）： 原假设 \(H_0\)为假，但我们未能拒绝它。
基础知识回顾：我们平时所说的p值就是与这里的α进行比较。p值公式可以简单理解为p-value = P(观察到的结果或更极端的结果|H0成立) ，即原假设成立的情况下观察到的结果成立的概率。我这里用基因表达比较来举个例子，针对geneA，我们的原假设H0是geneA在疾病组和对照组之间不存在差异，备择假设H1是存在差异，观察的结果就是指我们实际在抽样中算出来的两组之间的geneA的统计量，或者可以简单理解为数据差异（比如最简单的均值差异）。那么这个概率就是指，geneA在两组之间没有差异的情况下，我们实际看到的当前差异或者更极端的差异的概率。如果这个概率大于某个标准，也就是这里所说的α，我们认为数据符合H0假设，那么我们就同意它，反之则拒绝它。到这里可能有些没怎么接触过统计的人还会问一个问题：我们一般思考问题是，不应该是想尽办法来证明某个观点是对的吗（也就是H0是对的）？为何在统计检验中都是通过这种拒绝原假设的“反证法”来检验？这里有一句话我想分享一下：正向的个案不足以证明观点的正确性，但反向的却可以直接否定该观点。
单次检验
当我们只进行一次假设检验时，控制\(α\)即控制了假阳性率（Type I 错误率）。
如果设置 \(α = 0.05\) ，意味着有 5% 的概率拒绝一个实际上为真的 \(H_0\)。
那么，多次检验呢？
2. 多次独立检验时发生了什么？
当我们同时进行多次检验（即多重比较，例如比较A组和B组中10,000个基因的表达水平，是10,000次独立检验）时，每次检验都可能发生 Type I 错误。这些错误的概率会累积，导致总体假阳性率大幅提高。
假阳性累积的数学推导
假设我们进行 \(m\) 次独立检验，每次的假阳性率是 \(α\)，那么：
首先，每次检验不发生假阳性的概率为：
\(1 - α\)
接着我们可以得出\(m\)次检验都不发生假阳性的概率为：
\((1 - α)^m\)
至少一次假阳性发生的累积概率为：
\(P (至少一次假阳性) = 1 - (1 - α)^m\)
一个简单的例子，如果我们进行10次检验（或者比较两组之间10个基因的表达），这里的\(α\)我们就设置为常用的0.05：
\(P (至少一次假阳性) = 1 - (1 - 0.05)^{10} ≈ 0.40\)
也就是说，尽管每次检验的假阳性率是 5%，在10次检验中，至少出现一次假阳性的概率升到了 40%。如果检验次数增加到100次，累积假阳性概率会进一步上升：
\(P (至少一次假阳性) = 1 - (1 - 0.05)^{100} ≈ 0.994\)
这时候至少出现一次假阳性的概率高达99.4%，几乎可以说是必然出现假阳性了。所以这也是做p-value矫正的主要动机。
3. 如何解决多重比较问题？
为了控制总体的假阳性率，我们需要调整单次检验的p值或显著性水平。这就是p值矫正的目的。以下是常用的两个方法：
方法一：Bonferroni校正
核心思想： 降低每次检验的显著性水平，使得总体假阳性率仍然保持在设定的 \(α\)。
公式：\(p_{cut-off} = {α \over m}\)，这里的\(m\)是指检验次数（差异基因分析中就是基因个数）。
\(p_{cut-off} \)是指指调整后的显著性水平（校正后的阈值），它定义了多次检验中单个检验需要达到的显著性标准，以便控制总体假阳性率。
举个例子，我们原来设置的阈值是0.05，现在在我们的数据中有100个基因，那么矫正过的阈值\(p_{cut-off} \)就是\({0.05 \over 100} = 0.0005\)。换句话说这时候我们的p值就不是<0.05显著，而是<0.0005才算显著。那么我们通过计算得出的adjusted p-value是怎么得出来的呢？其实很简单，就是\(p-value_{original} * m\)。例如，geneA算出来的原始p值为0.001，那么这里\(0.001 * 100 = 0.1\)，也就是经过矫正后实际上geneA的表达在两组之间并没有显著差异。
然而Bonferroni方法也并不是十全十美，我们从上面的讲解中可以看出，经过校正后的p值阈值会变得非常低，换句话说接受原假设的要求会变得很严格，这种情况下虽然我们降低了Type I错误，但Type II错误的概率却提高了。因此，当当检验次数非常多（如 10,000+）时通常不建议用该矫正方法。
方法二：假发现率（FDR，False Discovery Rate）
核心思想： FDR 的目标是控制显著结果中的假阳性比例，而不是控制整体假阳性率（像 Bonferroni 那样严格）。
公式：\(FDR = {假阳性结果数 \over 所有显著结果数}\)
方法：对所有p值排序，之后可通过Benjamini-Hochberg (BH) 方法计算每个p值对应的FDR值。
Benjamini-Hochberg 是最常用的 FDR 控制方法，其步骤如下：
输入：
假设有\(m\)个独立检验，分别对应的p值为\(p_1, p_2, p_3, ..., p_m\)。
我们的目标是控制FDR要小于指定的阈值\(α\)（例如0.05）。
计算步骤：
排序p值：按照升序对原始p值进行排列。排完序后，每个p值对应一个ranking值\(i\)。
计算FDR值：对每个p值\(p_{(i)}\)，计算对应的FDR阈值\(q_{(i)}\)：\(q_{(i)} = {i \over m} * α\)。
比较p值与FDR值：找到最大的\(k\)，使得\(p_{(k)} ≤ q_{(k)}\)
输出：最后输出所有符合\(p_{(i)} ≤ q_{(i)}\)的结果。
以上理论可能有点抽象，我们举个具体例子来更好的理解。假设我们需要比较 10 个基因在疾病组和对照组之间的表达差异，得到以下 p 值（已排序）：
排序位置 (\(i\))
p 值 (\(p_{(i)}\))
FDR 阈值 (\(q_{(i)} = {i \over m} * α\), \(α = 0.05\))
1
0.001
0.005
2
0.003
0.01
3
0.008
0.015
4
0.02
0.02
5
0.03
0.025
6
0.04
0.03
7
0.06
0.035
8
0.08
0.04
9
0.1
0.045
10
0.15
0.05
根据以上的排序表，我们要确定一个\(k\)，也就是某个\(i\)，使得刚好\(p_{(k)} ≤ q_{(k)}\)。我们一个一个来看：
\(p_{(1)} =0.001 ≤ q_{(1)} = 0.005\)，那么可以认为这个确实是显著的。
\(p_{(2)} =0.003 ≤ q_{(2)} = 0.01\)，同上。
\(p_{(3)} =0.008≤ q_{(3)} = 0.015\)，同上。
\(p_{(4)} =0.02≤ q_{(4)} = 0.02\)，同上。
\(p_{(5)} =0.03 ≥ q_{(5)} = 0.025\)，这时候我们发现p值大于q值了，那么这里的\(k\)就是4，也就是说判定前 4 个基因是确实的显著。
最后，我们依然用原始的p值来表示这4个基因的显著性（为什么？q-value或者FDR主要用于判定显著性，而p值是实际报告原始数据的差异程度，这两者是不同的概念）。