研究背景
越来越多的神经类疾病未被攻克，威胁着人类的健康，所以认识大脑的全部功能并能治疗各种神经类疾病是每个神经类科研工作者致力的方向。涉及现实和伦理方面的限制，想要获取实验使用的脑组织存在困难，传统上常使用某些多如啮齿类动物作为模式生物，用于神经科学的研究。但是，人和啮齿类动物的脑组织结构和发育相似度并不是很高，因此在体外培养脑类器官是一件非常急需解决的问题。
科研人员可以通过分化人多能干细胞（hPSCs），包括诱导多能干细胞（ips）和胚胎干细胞（ES），来获取神经细胞，在体外模拟人的环境，培养出脑类器官，有利于研究者发展治疗手段，从而治愈疾病。
培养方案
文献一
研究团队开发了一种将人类多能干细胞分化为表达人类中脑特征标志物的神经元细胞层的方法，将患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs，然后置于添加FGF-basic（碱性成纤维细胞因子）、CHIR-99021，MEK抑制剂（PD0325901）的培养基中培养。
DMEM/F12的神经元诱导培养基：神经基础、1：100 N2、1：50 B27去除维生素A、1% 谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制剂Y-27632、0.1% β-巯基乙醇、1 μg/mL肝素。前48 h加入Y-27632，第2天改变神经元诱导培养基。
3天后，hMLOs开始挤压神经外胚层芽。去除培养基，并立即使用配备预冷200 μL移液管尖端的移液管向每个孔中加入30 μL还原生长因子基质胶。将基质嵌入的中脑类器官放入37°C培养箱30 min，使基质凝固。
生长在组织生长诱导培养基中含有神经基础培养基，1：100 N2、1：50 B27去除维生素A、1% 谷氨酰胺、0.1% β巯基乙醇、2.5 μg/mL胰岛素、200 ng/mL层粘连蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。
分化培养基，包括神经基础培养基、1：100 N2、1：50 B27去除维生素A、1% 谷氨酰胺、100 μM抗坏血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β巯基乙醇、10 ng/mL BDNF，10 ng/mL GDNF。培养基中加入了双抗，以防止长期培养过程中潜在的细菌污染。每3天更换一次培养基。[1]
图1.人中脑样类器官每个阶段细胞的典型形态（SBNC：SB-431542、CHIR-99021、Noggin）[1]
图2.神经元免疫染色[1]
文献二
额颞叶痴呆是一种非常严重的神经系统疾病，会导致患者的行为、言语和思考出现问题。已知tau蛋白的突变和该疾病息息相关，但是具体的作用机制并不十分清楚。因此，研究团队利用人源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）在体外构建了额颞叶痴呆的大部分损伤的大脑类器官模型，表达tau突变蛋白，从而揭示神经元损伤的早期的分子水平变化，阐述致病机理，并发现一种药物Apilimod能抑制神经元的死亡。
球形形成培养基（SFM）：E8培养基和10 mM ROCK抑制剂Y-27632组成。每个球状体添加1 mL培养基。将球状体轻轻混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小时。
分化培养基由E6培养基添加2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；将球体转移到16ml离心管，静置使球体沉降， 吸去上清，用分化培养基替换，转移至超低吸附10 cm培养板（每板9 mL培养基 + 1 mL球体悬液）。
每日换液，连续5天（~65%培养基更换）。
第6天，将培养基改为神经培养基（NM），其组分包括Neurobasal-A、B27去除维生素A、GlutaMAX和抗A，并添加20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF2。
第6-15天每日换液，第16-24日隔日换液。
第25天，更换为分化培养基C（Neurobasal-A、B27去除维生素A、GlutaMAX和抗A，20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3），隔日换液，补充65%培养基。
第26天，从第43天开始，每3-4天更换一次NM培养基，不添加生长因子，每个培养皿15-20 mL，75%培养基更换。在整个培养期间，定期用无菌手术刀分离融合的类器官。在下图的实验中，诱导多能干细胞被生长和模式化。[2]
图3.脑类器官中神经元存活的纵向轴[2]
图4. 5 mM谷氨酸处理tau-V337M和等位基因V337V类器官图像[2]
图5.5 mM谷氨酸盐和DMSO处理tau-V337M类器官图像[2]
图6.apilimod可逆转tau-V337M类器官对谷氨酸兴奋毒性的敏感性[2]
文献三
人类大脑发育表现出几个独特的方面，如复杂性的增加和神经元输出的扩大，已被证明很难在模式生物中进行研究。因此，体外方法模拟人类大脑发育和疾病是一个热门的研究领域。
Madeline A. Lancaster和Juergen A. Knoblich研究团队建立了类脑器官培养模型，能模仿内源性发育程序，该模型能在标准组织培养室内进行培养，在1~2个月内即可发育出大脑皮层、腹侧端脑、视网膜等。这个方案可以应用于发育研究以及各种人类大脑疾病的研究。
此外，由于类器官可以在长期培养中维持一年以上，它们也有可能模拟后期事件，如神经元成熟和存活。
以下是文章中的脑类器官培养步骤：
胚状体（EB）形成：确保hPSCs达到70-80%汇合度，形态良好（边界清晰、质地均一，分化<5-10%）吸去培养基，加入1ml D-PBS（无钙镁）洗涤；加1ml Dispase溶液，37°C孵育20-30min。吸去Dispase，加1ml低bFGF hESC培养基（DMEM-F12 400ml，KOSR 100ml，hESC级FBS 15ml + GlutaMAX 5ml + MEM-NEAA 5ml + 2-巯基乙醇 3.5μl，bFGF 4ng/ml）；转移至15ml离心管，静置1min使集落沉降；吸去上清（含单细胞和MEFs），重复洗涤一次；1ml Trypsin/EDTA，37°C孵育2min；加1ml胰酶抑制剂，用1ml枪头吹打至浑浊；取2个5μl样品计数，加8ml低bFGF培养基，270g离心5min；先用1ml低bFGF+ROCK抑制剂 Y27632（1:100，终浓度50μM）重悬补足体积至9,000
活细胞/150μl；96孔U底板每孔接种150μl。
EB培养与胚层分化：第一天观察小EB形成，第二天起，每2天半量换液（低bFGF hESC培养基），当EB直径>350-400μm，换为不含ROCK抑制剂和低bFGF的hESC培养基;第六天左右EB应达到500-600μm，表面变亮且有光滑边缘。
原始神经上皮诱导：用剪过的200μL头（开口1-1.5mm）转移每个EB；转移至24孔超低吸附板，每孔1个EB + 500μl神经诱导培养基；48h后（Day 8）：添加500μL新鲜神经诱导培养基（DMEM-F12 + 1% N2 + 1% GlutaMAX + 1% MEM-NEAA + 肝素 1μg/ml)，第10-11天观察：外周变亮，出现放射状假复层上皮。
Matrigel包埋：基质胶4°C融化，Parafilm覆盖枪头盒，压出4×4=16个凹坑；剪下含16凹坑的Parafilm，放入60mm培养皿；用剪过的200μl枪头（开口1.5-2mm）转移神经上皮组织；用未修剪的200μL枪头吸去多余培养基，立即滴加~30μl Matrigel覆盖组织，用10μL枪头将组织拨至液滴中央，37°C孵育20-30分钟，加入5mL分化培养基（DMEM-F12 + Neurobasal+ N2 + 胰岛素 + GlutaMAX + MEM-NEAA + 青霉素-链霉素 + 2-巯基乙醇稀释液 + B27 去除维A ），用无菌镊子翻转Parafilm，摇晃使液滴脱落。
静态培养神经上皮芽扩张：第十三天半量换液；第十五天全量换液；
转入动态培养系统：使用轨道摇床孵育，60mm培养皿，转速85 rpm，每3-4天换液一次。分化培养基为DMEM-F12 + Neurobasal+ N2 + 胰岛素 + GlutaMAX + MEM-NEAA + 青霉素-链霉素 + 2-巯基乙醇稀释液 +B27。[3]
图7.人PSCs脑类器官发育的进展[3]
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参考文献
[1] Jo J, et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 2016 Aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27476966; PMCID: PMC5510242.
[2] Bowles K R, et al. ELAVL4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in MAPT mutation cerebral organoids[J]. Cell, 2021(Suppl 5).
[3] Lancaster M A, Knoblich J A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[J]. Nature protocols erecipes for researchers, 2014.